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      NATE拍了拍你,快用我提高轉染效率~

      作者:admin信息來源:達科為日期:2020年07月10日打印字體:  
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      為什么轉染效率低?

      真核細胞轉染過程中,外源核酸(如質粒DNA)進入細胞會遇到一些阻礙,一方面胞質DNA和RNA感受器(如RIG-I樣受體,cGAS和炎癥小體)會識別這些外源核酸, 另一方面外源核酸需要避開防御性機制(如自噬),因此外源核酸引起的信號級聯激活通常會導致細胞轉染效率降低和細胞活力降低。

      如何提高轉染效率?

      NATE?是一款專門開發的核酸轉染增強劑,可抑制許多核酸感應途徑,從而保護外源DNA并促進其表達,用于提高難轉細胞(如THP-1和RAW 264.7)的轉染效率。與常用的轉染試劑(如GeneXPlus,Lipofectamine?LTX和jetPRIME?)、物理方法(電轉)以及慢病毒轉染等兼容,只需在轉染步驟前添加NATE?孵育30分鐘,即可進行后續轉染操作。

      NATE怎么用?

      準備分裝的儲存液(100 x NATE)(????以下為單瓶的準備步驟)

      • 向每瓶加入250ul DMSO進行溶解;

      • 劇烈渦旋確保薄膜完全溶解;

      • 向瓶中加入250ul無菌去內毒素水再次渦旋;

      • 分裝置于-20°C保存。

      穩轉/瞬轉實驗使用NATE


      (以下是在THP-1和RAW264.7細胞的瞬時和穩定轉染中使用NATE的詳細步驟,該方案適用于多種瞬時和穩定轉染,包括不同大小的細胞培養板(6/12/24孔板),不同的轉染方法和不同大小的質粒)

      a、細胞準備

      1. 如往常一樣,在完全培養基中準備待轉染的細胞(如THP-1或RAW264.7)。

      • RAW264.7轉染注意事項:在加入NATE和開始轉染步驟前,必須將細胞接種24h;

      • THP-1轉染注意事項:轉染效率取決于細胞的培養方式。每三天將細胞分為起始密度至0.5 x 10^6 cells/ml;

      • THP-1穩轉注意事項:建議在轉染過程中使用豐富培養基(即在普通培養基中加入20%血清、20%條件培養基、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和抗氧化劑);

      b、添加NATE

      2. 添加100 x NATE儲存液至終濃度為1 x。添加量(添加1%)根據使用的平板和培養基體積而變化。

      • 注意:例如,在轉染中使用1mL細胞培養基時,向細胞加入10 ul NATE。

      3. 輕晃培養板使NATE均勻分布到細胞中。

      4. 在正常細胞培養條件下孵育至少30分鐘。

      c、轉染

      5. 按照轉染試劑說明書進行轉染操作(包括聚合物或脂質體轉染,病毒轉染或電轉)。

      • 注意:如果轉染方法要求在轉染后短時間內更換培養基,必須在新培養基中重新加入NATE。

      6a. 對于瞬時轉染:在適當條件下培養24-48h,以便進行基因表達的檢測。

      6b. 對于穩定轉染:在轉染后2-4天使用抗生素進行篩選。延遲篩選可使細胞狀態從轉染中恢復。

      • THP-1細胞穩轉注意事項:當選擇效率開始提高時,建議使用適當試劑盒去除死細胞。

      轉染使用舉例

      (下表是使用NATE轉染THP-1或RAW264.7細胞的示例)



      相關篩選抗生素


      更多信息請瀏覽:

      www.eastong2008.cn                  

      www.invivogen.com

      常見問題

      Q1

      NATE包裝瓶里看不到有東西是正常的嗎?

      A1:產品量較少且是半透明薄膜形式,幾乎看不到,建議先進行離心再溶解,最好不要打開瓶子的乳膠塞,可以打開鋁蓋后使用注射器將DMSO注入瓶內進行溶解。

      Q2

      NATE能否只用DMSO溶解?無菌無內毒素水可用什么替代?

      A2:說明書溶解條件是經過優化的,建議按照說明書步驟進行溶解(先:DMSO;后:無菌去內毒素水);可使用醫用級注射用水替代。


      InvivoGen 1977年成立于法國,是法國最早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細胞培養相關試劑,如抗支原體、細菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素(Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin)。隨著天然免疫研究熱點的興起,InvivoGen于2000年開始致力于天然免疫相關產品的研發和生產,并成為全世界最優質、最專業的天然免疫相關產品生產商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案,包括不斷更新的模式識別受體(PRRs)激動劑和拮抗劑,PRRs報告基因細胞以及天然免疫信號通路的誘導劑和抑制劑等。


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